本发明公开了一种重组大肠杆菌及其构建方法和应用，所述重组大肠杆菌可用于L‑苯丙氨酸的生产。本发明利用多轮诱变筛选对L‑苯丙氨酸结构类似物具有高抗性，且具有酪氨酸营养缺陷型突变菌株，并以温敏型重组质粒形式调控L‑苯丙氨酸合成途径中编码3‑脱氧‑7‑磷酸庚酸合酶和分支酸变位酶基因表达。本发明构建的重组大肠杆菌，在5 L发酵罐中，根据菌体生长阶段采取不同控温和补料方式，发酵时间为56 h条件下，L‑苯丙氨酸产量在62 g/L，糖酸转化率为25.2%，具有工业化应用前景和价值。