本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉及一种重组人源化Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明经筛选活性高、稳定性高、水溶性好的序列拼接成一段全新的人源化Ⅲ型胶原蛋白序列，其核苷酸序列经毕赤酵母密码子偏好性优化，并通过多位点整合质粒介导的重组菌构建方法，构建了一株高产重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的工程酵母菌株，该菌株较优化前发酵上清液目标蛋白的浓度提高了2倍。上述技术方案制备得到的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白与市售的胶原蛋白产品相比，其抗氧化及促细胞迁移等生物活性效果更好，因此具有良好的实际应用之价值。