本发明提供了一种肝素酶突变体H1‑6及其工程菌株和应用，属于蛋白突变技术领域。本发明提供的肝素酶突变体H1‑6，是在野生型肝素酶氨基酸序列的基础上进行了以下突变：P10R、V45A和L160P。本发明对来源于拉乌尔菌属(Raoultellasp.)的肝素酶基因采用CepPCR与MegawhopPCR结合的易错PCR技术进行随机突变，高通量筛选获得高酶活的肝素酶突变体。实验结果表明，重组表达的肝素酶突变体菌株的酶活为3726U/L以上，比野生型肝素酶酶活提高了97.6％以上，具有较高的应用价值。