本发明提供了一种生物样本中硫化氢的检测方法及其应用，涉及硫化氢检测的技术领域。该检测方法包括对样本进行前处理，使样本中的硫化氢反应生成亚甲基蓝，然后采用LC‑MS检测样本中的亚甲基蓝，将LC‑MS检测获得的亚甲基蓝检测值带入标准曲线中，计算得到亚甲基蓝对应的硫化氢的含量；前处理包括使用氢氧化锌悬浊液与样本中的硫化氢反应，得到含有硫化锌的沉淀，然后在酸性介质中和三价铁离子存在的条件下，与N,N‑二甲基对苯二胺反应，生成亚甲基蓝。该检测方法具有准确度和灵敏度高，和检测速度快的优点。