本发明公开了一种疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法和应用，所述耐热冻干保护剂包括A溶液和B溶液，每升所述A溶液由以下组分组成：NZ‑胺35～40g、谷氨酸钠3～4g、蔗糖300～330g、水解乳蛋白20～30g、Vit C3～3.3g、100×蛋白酶抑制剂48～52ml。本冻干保护剂在病毒冻干过程中冻干损失极小，冻干前后几乎无病毒损失，毒种冻干后保存时间长，在2～8℃静置保存42个月损失不超过0.5log10；冻干保护剂对毒种的耐老化具有很好的抵抗作用；此外，对室温条件下的病毒保护也具有良好的作用，可延长毒种在室温条件下的存活时间，避免细胞源毒种中蛋白酶的降解作用，在临床使用过程中具有重要意义，可提升操作的便捷性。