本发明公开一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。本发明提供的重组菌在酿酒酵母中对β‑酮酰辅酶A硫解酶基因进行敲除或失活，或降低该基因的表达或活性，可以产生甲基酮。配合过表达内源酰基辅酶A氧化酶基因，或(3R)‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶/2‑烯酰辅酶A水合酶2基因，或酰基辅酶A硫酯酶基因，或脂酰辅酶A转运蛋白编码基因，或外源β‑酮酸脱羧酶基因中的一种或多种，大大提高产生甲基酮的能力。进一步配合过表达外源氧化酶基因，或水合酶基因，或脱氢酶基因，或硫酯酶基因，或脱羧酶基因中的一种或多种，可进一步提高产生甲基酮的能力。本发明通过实验证明获得的重组菌具有较大实际应用价值。