本发明提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，通过将目标基因突变的方式制备，所述目标基因为羊传染性脓疱病毒ORF120基因。所述缺失ORF120基因的羊传染性脓疱病毒是采用基因工程手段，利用同源重组的方法从ORFV‑SY17分离株全基因组中敲除ORF120基因，以此达到毒力减弱的目的，并以绿色荧光蛋白EGFP作为标记蛋白代替缺失的基因，命名为ORFV‑SY17Δ120减毒株。在此基础上，拯救出其互补株ORFV‑SY17‑Rv120，并以红色荧光蛋白RFP作为筛选标识。经过本源动物羔羊动物接种实验表明，本发明所述的ORF120单基因缺失羊传染性脓疱病毒减毒株具有良好的使用安全性，为羊传染性脓疱病毒减毒活疫苗的开发以及ORF120基因功能的探究提供技术支持。