本发明提供了一种鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物、探针及其应用。本发明的引物包括如SEQ ID NO.1所示序列的引物和如SEQ ID NO.2所示序列的引物。本发明的探针包括如SEQ ID NO.5所示序列的探针。本发明的探针进一步包括如SEQ ID NO.6所示序列的探针。利用本发明的引物和探针，可通过PCR方法将新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系与其它毒株鉴别区分开。