本发明公开了一种异源表达黑芥子酶的重组毕赤酵母及其在萝卜硫素制备中的应用，属于生物工程技术领域。本发明首先构建得到一种可异源表达黑芥子酶的重组菌株，并利用该重组菌株发酵生产黑芥子酶后，通过固定化酶催化萝卜硫苷生成萝卜硫素。采用本发明提供的重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZα‑BMYR制备得到的含有甘蓝蚜虫来源的BMYR在3L发酵罐中制备萝卜硫素时，产量达到0.91g/L，萝卜硫苷的摩尔转化率达到90％，本发明提供的这种生物法制备萝卜硫素的方法，具有反应条件温和、工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。