本发明涉及一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用。以pGAPZα‑A质粒为模板PCR扩增获得启动子GAP基因片段；将扩增的启动子GAP基因片段通过双酶切后，连接到pGAPZα‑A‑NKt2上，构建pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组载体；将pGAPZα‑A‑GAP‑GAP‑NKt2重组载体通过电转化毕赤酵母X33中，获得双启动子系统重组基因工程菌LNF013。本发明成功构建双启动子毕赤酵母真核体系表达的纳豆激酶重组基因工程菌，纳豆激酶表达量及酶活性显著提高，为今后纳豆激酶大规模的应用奠定了基础。