本发明公开了一种利用嘧啶类缩合剂点击构建酰胺键的方法及其在酰胺和多肽合成中的应用。其中，酰胺键的构建方法为：在羧酸组分和胺组分中加入溶有有机碱的有机溶剂，搅拌反应后加入溶有嘧啶类缩合剂的有机溶剂，继续搅拌反应后浓缩、分离纯化，得到酰胺或多肽产物。本发明酰胺键构建方法缩合剂使用量少，且缩合剂本身安全无味易储存，具有很好的原子经济性。所述酰胺键构建反应时间仅需数秒至十分钟，极大地缩短了酰胺或多肽合成时间。另外，本发明酰胺键构建反应也可在有机相‑水相的双相体系，以及在有机相‑水相的双相体系和不添加碱的条件下也能快速发生，这为对碱敏感的生物体系中的酰胺键构建反应提供了一种温和可行的路径。