本发明提供了一种环丁烯衍生物的制备方法及其在制备荧光标记试剂中的应用。该环丁烯衍生物的结构如式I所示。实验表明，本发明提供的环丁烯衍生物具有优异的稳定性，同时在与四嗪类化合物发生生物正交反应时具有快速的反应速度，因此，本发明的环丁烯衍生物在生物正交反应激活前在复杂的生物体系中能够保持良好的稳定性，而且在生物正交反应激活后，能够与带荧光基团的目标蛋白上的四嗪结构快速发生生物正交反应，开启荧光，实现对该目标蛋白的荧光标记。本发明提供的环丁烯衍生物能够用来制备荧光标记试剂，发挥荧光标记的作用，在活体追踪、荧光成像等领域具有广阔的应用前景。