本发明属于纳米孔检测技术领域，具体公开一种基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统及其制备与使用方法。本发明的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统，结合固态纳米孔单分子传感器使用，其由一条线性DNA长双链及固定在其上的一个DNA四面体构成；DNA四面体内部与目标蛋白适配，目标蛋白在DNA四面体的结构内的结合位置可人工调整。本发明还提供上述系统的制备方法和使用方法。使用本发明的系统可以通过电信号分析出蛋白分子过孔时的空间位置以及过孔方向，进一步可控制蛋白的空间方向。