本发明属于细胞培养的技术领域，公开了一种提高人多功能干细胞体外悬浮培养的效率的方法。所述提高人多功能干细胞体外悬浮培养效率的方法：将人多功能干细胞用含聚乙烯醇或葡聚糖硫酸酯与聚乙烯醇的培养基进行三维培养；所述葡聚糖硫酸酯在培养基中的浓度为10～100ug/ml；所述聚乙烯醇在培养基中的浓度为0.1～1mg/ml。本发明的方法不仅能够减少细胞聚集体的大小且得到尺寸均一的聚集体，还能达到较高的细胞数量以满足体外扩增人多功能干细胞的需求，提高了人多功能干细胞的培养效率。