本申请公开了一种用于Small RNA的测序方法、测序试剂和应用。本申请用于Small RNA的测序方法，包括在对混合样本的环状文库进行测序时，向引物溶液中添加正常测序引物和阻断测序引物，采用混合引物进行测序；阻断测序引物由正常测序引物3’末端羟基经化学修饰而成。本申请的测序方法，通过添加阻断测序引物，使得混合样本环状文库Small RNA测序得以实现，并能有效的保障标签序列的测序，进而提高了数据利用率，得到良好的拆分率。本申请的Small RNA测序方法和测序试剂，为Small RNA混合样本测序提供了一种新的思路和方案，解决了目前的环状文库Small RNA测序的测序资源浪费等问题。