本发明涉及一种2，4，5‑三氨基‑6‑羟基嘧啶硫酸盐及叶酸的制备方法，包括以下步骤:氰乙酸酯与亚硝酸钠，在有机溶剂和/或无机溶剂、酸性物质的作用下，得到2‑肟基氰乙酸酯；然后与盐酸胍在碱性条件下，反应得到2，4‑二氨基‑5‑异亚硝基‑6‑氧代嘧啶；再与氢气在Pd/C的作用下，在碱性条件下，反应得到2，4，5‑三氨基‑6‑羟基嘧啶，加硫酸调节PH，得到2，4，5‑三氨基‑6‑羟基嘧啶硫酸盐；再添加三氯丙酮和N‑(4‑氨基苯甲酰)‑L‑谷氨酸摩，在缓冲溶液中，催化剂分子筛作用下，制得叶酸。本发明以上述工艺路线为基础，探索不同反应步骤及精制条件对2，4，5‑三氨基‑6‑羟基嘧啶硫酸盐及叶酸制备路线的影响，旨在提高收率的同时减少废水污染。