本发明涉及到生物技术领域，具体涉及整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用，包括如下步骤：pTargetT‑X::PtetF18重组质粒的构建；通过整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株且表达展示在细胞表面。相对于现有技术，本发明的有益效果为：去除Nissle1917益生菌原有质粒，无抗性基因的存在；该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞（IPEC‑1）的粘附性能；口服免疫小鼠能产生免疫血清，即抗F18菌毛的IgG的抗体；口服免疫后小鼠血清能显著减低F18+菌株对猪肠道传代细胞系IPEC‑J2的粘附。