本发明涉及一种生物芯片及其制备方法，所述生物芯片包括上基底、填充层和下基底，所述填充层分别与下基底、上基底键合，所述填充层的上表面设置有流道，所述填充层上表面的流道与上基底的下表面键合形成流动池，所述上基底上设置有若干个孔，所述孔包括若干个进液孔和若干个出液孔，所述流道两端分别与进液孔、出液孔连通；所述流道包括第一流通段和第二流通段，所述第一流通段的两端分别与进液孔、出液孔连通。本发明的芯片密封性能好，能承受较高正负压，密封过程中没有高温等极端工况，适用于把样品、核酸探针固定到流道，再进行密封；本发明适于生物芯片领域，具有成本低、工艺简单、易于大批量商业化生产。