本发明公开了一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂，该方法包括如下步骤：使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，形成两端连接第一接头并形成缺口的片段；在缺口处连接第二接头；进行第一PCR反应，得到两端分别连接第一接头和第二接头序列的产物；酶切产生切口，然后进行双链环化产生环状核酸分子；从切口处进行限制性缺口平移反应；消化未发生限制性缺口平移反应的部分；连接第三接头和寡核苷酸接头序列；进行第二PCR反应，得到两端分别连接第三接头和寡核苷酸接头序列的产物；分离出核酸单链；对核酸单链进行环化，得到单链环状文库。本发明的方法通过转座酶打断与限制性缺口平移反应结合，实现简单、快速的核酸单链环状文库的构建。