本发明涉及一种基于光斑检测的可视化样品定位操作系统及方法，它包括可见光激光光源、准直扩束单元、光束聚焦单元、电控移动样品台、CCD图像采集单元和计算机，电控移动样品台上装载有一待测样品；可见光激光光源出射的可见激光依次经准直扩束单元和光束聚焦单元后形成锥形标示光路，标示光路发射到待测样品上形成标示光斑，CCD图像采集单元采集标示光斑并将其发送到计算机，计算机对接收的标示光斑图像进行处理得到标示光斑参数信息，通过标示光斑信息判断标示光斑的离焦状态进而搜索得到对焦位置，并根据搜索得到的对焦位置控制电控移动样品台对待测样品位置进行调节，实现待测样品的自动对焦。本发明可以广泛应用于样品自动定位操作中。