本发明属于植物免疫检测技术领域。具体涉及一种分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单克隆重组抗体的制备与应用。将伏马菌素B1分别与载体蛋白KLH和BSA偶联得到抗原，用所得FB1-KLH抗原免疫小鼠，细胞融合后进行选择性培养，利用FB1-BSA偶联物对杂交瘤细胞进行筛选，经亚克隆获得稳定分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5。通过抗体基因库技术和噬菌体展示技术筛选杂交瘤细胞株2C5的单克隆重组抗体H7。本发明对单克隆抗体和重组抗体进行了大量生产和纯化，所得的2C5单克隆抗体和H7重组抗体可用于伏马菌素的免疫检测。