本发明提供一种检测耳聋相关的线粒体DNA T7505C突变的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T7505C片段的PCR混合液、针对T7505C设计的一对外引物、针对T7505C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照和盒体组成。本发明运用蛋白酶K消化裂解法，从少量标本中快速提取基因组DNA，不仅解决了传统上从耳聋患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦；而且还解决了跨地区传递样本的问题。本发明的试剂盒应用成本低，检测流程简便、快速，结果判读直观，应用本发明可确保检测结果的特异性和稳定性，可在检测与耳聋相关的线粒体基因tRNAGln T7505C突变中的应用。