公开(公告)号：CN114395568A

公开(公告)日：2022-04-26

申请号：CN202111274202.1

申请日：2021-10-29

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李燕华 ,  周弇扬 ,  李晨曦 ,  任次成 ,  胡晶博

IPC: C12N15/50 ,  C12N7/01 ,  C12N15/63 ,  C12N15/12

Abstract: 本发明提供了猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用，本发明属于生物技术领域。该构建方法包括：以猪流行性腹泻病毒的基因组RNA反转录产物为模板，扩增F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7片段；基于酵母内同源重组机制，将线性化的pYES1L载体和F1～F7片段混合、转化如酵母感受态细胞，从而实现病毒cDNA片段与原载体的一步无缝连接得到猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆质粒；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，将病毒ORF3编码区替换成绿色荧光蛋白基因，构建表达绿色荧光蛋白的重组猪流行性腹泻病毒。本发明所述方法快速简便、成功率高，可用于拯救猪流行性腹泻病毒及其它冠状病毒，为研究该病毒的复制机制、致病机理以及开发新型疫苗提供可靠的技术平台。

公开(公告)号：CN114395583B

公开(公告)日：2024-03-29

申请号：CN202111284075.3

申请日：2021-11-01

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李燕华 ,  任次成 ,  周弇扬 ,  李晨曦

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/40 ,  C12N15/53 ,  C12N7/01 ,  C12Q1/04 ,  C12Q1/70 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。

公开(公告)号：CN114395583A

公开(公告)日：2022-04-26

申请号：CN202111284075.3

申请日：2021-11-01

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李燕华 ,  任次成 ,  周弇扬 ,  李晨曦

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/40 ,  C12N15/53 ,  C12N7/01 ,  C12Q1/04 ,  C12Q1/70 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。