在果蝇细胞中高表达人GAD65蛋白的基因序列和蛋白制备方法

    公开(公告)号:CN106399336B

    公开(公告)日:2017-12-05

    申请号:CN201610771314.0

    申请日:2016-08-30

    Abstract: 本发明提供一种高表达人GAD65蛋白的基因序列和蛋白制备方法,真核宿主为果蝇S2细胞。通过探讨密码子使用种属偏好性,对人GAD65的原始基因序列进行密码子优化,得到一个可提高重组蛋白表达效率的全新GAD65基因序列,如SEQ NO.1所示。本发明提供了承载人全新GAD65序列的果蝇细胞高表达载体,包含如SEQ NO.1所示的GAD65基因序列。GAD65含有StrepII标签,通过一步亲和层析纯化即可获得高纯度、高免疫原性的GAD65蛋白,大大提高了重组蛋白的得率并降低了成本。本发明改变了传统的用酵母或昆虫杆状病毒表达系统获得人GAD65的方法,首次利用果蝇S2细胞这一高密度连续培养体系大量表达GAD65,通过StrepII标签快速制备高纯度、低成本并具有良好免疫原性的人GAD65蛋白。

    承载GAD65p271-284肽段的I-Ag7果蝇细胞高表达基因序列和构建的Tetramer

    公开(公告)号:CN105861530A

    公开(公告)日:2016-08-17

    申请号:CN201610209102.3

    申请日:2016-04-06

    Inventor: 孙意 周智广

    Abstract: 本发明提供了承载GAD65 p271?284肽段的I?Ag7果蝇细胞高表达基因序列,包含如SEQ NO.1所示的MHC II?α?Fos?BSP融合基因序列以及如SEQ NO.2所示的GAD65p271?284?MHC II?β?Jun融合基因序列。还提供了承载GAD65 p271?284肽段的I?Ag7的Tetramer,将SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的序列分别克隆到表达载体中,再同时转染到果蝇细胞中表达,将得到的MHC II?α?Fos?BSP和GAD65p271?284?MHC II?β?Jun融合蛋白形成异源二聚体生物素化,最后与荧光素标记的链霉亲和素结合,即形成承载GAD65 p271?284肽段的I?Ag7的Tetramer。本发明通过探讨种属偏好性表达,拟找到最佳的表达序列,最终提高重组蛋白的表达效率。

    调节性T细胞囊泡的制备方法、复合水凝胶及其应用

    公开(公告)号:CN115737543B

    公开(公告)日:2024-12-06

    申请号:CN202211597727.3

    申请日:2022-12-12

    Applicant: 中南大学

    Inventor: 俞海波 周智广

    Abstract: 本发明公开了一种调节性T细胞囊泡的制备方法、复合水凝胶及其应用,所述调节性T细胞囊泡复合水凝胶包括调节性T细胞囊泡和水凝胶,所述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比为:0.5~5g/L,所述调节性T细胞囊泡的制备方法包括:从脐血中提取调节性T细胞,对提取的调节性T细胞进行扩增,得到扩增后的脐血调节性培养液;取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清,进行至少一次离心处理,收集离心后的上清;取所得上清,再次进行至少一次离心处理,收集沉淀,获得调节性T细胞囊泡。本发明提供的调节性T细胞囊泡复合水凝胶能明显促进创口愈合,对治疗糖尿病创面愈合有很好的治疗效果。

    一种优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法

    公开(公告)号:CN115305237B

    公开(公告)日:2023-07-14

    申请号:CN202210805512.X

    申请日:2022-07-08

    Applicant: 中南大学

    Inventor: 俞海波 周智广

    Abstract: 本发明公开了一种优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法,包括如下步骤:制备含有脐血调节性T细胞的重悬液;将含有脐血调节性T细胞的重悬液转移至与磁极配套的无菌管中,磁性分选出CD4+CD25+CD127‑调节性T细胞;在带有磁珠的调节性T细胞中加入扩培液进行培养,初始培养1~2天后,每隔1~3天继代培养一次,共培养40‑50天。本发明的方法,通过一步法分选,细胞扩增效果很好(时间缩短、细胞活性好),不仅有效扩增时间由18增加到40‑50天,而且增效果不会逐渐变差,大大增加调节性T细胞扩增代数和数目,能够满足临床患者的需求。

    调节性T细胞外泌体的制备方法及应用

    公开(公告)号:CN116355847A

    公开(公告)日:2023-06-30

    申请号:CN202310284707.9

    申请日:2023-03-22

    Inventor: 俞海波 周智广

    Abstract: 本发明公开了一种调节性T细胞外泌体的制备方法及应用,包括如下步骤:从脐血中提取调节性T细胞,对提取的调节性T细胞进行扩增,得到扩增后的脐血调节性培养液;取扩增后的脐血调节性培养液的上清,在200~10000×g的离心力下进行至少一次离心处理,收集离心后的上清;取所得上清,在3000~20000×g的离心力下进行至少一次离心处理,收集离心后的上清;取所得上清,对所得上清进行过滤和离心处理,获得调节性T细胞外泌体;或使所得上清经纳米孔通过,以去除其中杂蛋白,获得调节性T细胞外泌体。所得调节性T细胞外泌体具有抑制糖尿病患者的炎症细胞的增殖能力,可应用于糖尿病药物中。

    调节性T细胞囊泡的制备方法、复合水凝胶及其应用

    公开(公告)号:CN115737543A

    公开(公告)日:2023-03-07

    申请号:CN202211597727.3

    申请日:2022-12-12

    Applicant: 中南大学

    Inventor: 俞海波 周智广

    Abstract: 本发明公开了一种调节性T细胞囊泡的制备方法、复合水凝胶及其应用,所述调节性T细胞囊泡复合水凝胶包括调节性T细胞囊泡和水凝胶,所述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比为:0.5~5g/L,所述调节性T细胞囊泡的制备方法包括:从脐血中提取调节性T细胞,对提取的调节性T细胞进行扩增,得到扩增后的脐血调节性培养液;取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清,进行至少一次离心处理,收集离心后的上清;取所得上清,再次进行至少一次离心处理,收集沉淀,获得调节性T细胞囊泡。本发明提供的调节性T细胞囊泡复合水凝胶能明显促进创口愈合,对治疗糖尿病创面愈合有很好的治疗效果。

    一种高复苏率的冻存脐带血调节性T细胞的体外扩增方法

    公开(公告)号:CN115305236A

    公开(公告)日:2022-11-08

    申请号:CN202210805505.X

    申请日:2022-07-08

    Applicant: 中南大学

    Inventor: 周智广 俞海波

    Abstract: 一种高复苏率的冻存脐带血调节性T细胞的体外扩增方法,包括如下步骤:将一次扩增后的冻存脐带血调节性T细胞进行复苏,并用无血清培养液对细胞进行重悬;将得到的重悬液加入扩培液进行二次扩增培养,初始培养1~2天后,每隔1~3天继代培养一次,共培养13天以上;该扩培液中还添加IL‑2。本发明的方法,能够将已扩增过的冻存后的调节性T细胞进行再次复苏扩增,且复苏后二次扩增的调节性T细胞其活性能够达到90%以上,而且还可以继续扩增(如三次扩增、四次扩增),扩增后的细胞还可以用于临床治疗,大大缩短了临床患者等待调节性T细胞的时间,能够满足临床随需随取。

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