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公开(公告)号：CN114395568A
公开(公告)日：2022-04-26
申请号：CN202111274202.1
申请日：2021-10-29
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明提供了猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用，本发明属于生物技术领域。该构建方法包括：以猪流行性腹泻病毒的基因组RNA反转录产物为模板，扩增F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7片段；基于酵母内同源重组机制，将线性化的pYES1L载体和F1～F7片段混合、转化如酵母感受态细胞，从而实现病毒cDNA片段与原载体的一步无缝连接得到猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆质粒；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，将病毒ORF3编码区替换成绿色荧光蛋白基因，构建表达绿色荧光蛋白的重组猪流行性腹泻病毒。本发明所述方法快速简便、成功率高，可用于拯救猪流行性腹泻病毒及其它冠状病毒，为研究该病毒的复制机制、致病机理以及开发新型疫苗提供可靠的技术平台。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN115073613B
公开(公告)日：2025-02-11
申请号：CN202210747717.7
申请日：2022-06-28
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明涉及一种融合蛋白GLuc‑p30及其制备方法和应用，以非洲猪瘟的p30蛋白为诊断抗原，建立了一种基于荧光素酶免疫沉淀系统的非洲猪瘟抗体检测方法，该方法通过DNA转染真核细胞制备荧光素酶与p30的融合抗原，将该抗原分泌到细胞外，融合抗原与血清样本中的非洲猪瘟抗体结合后，被金黄色葡萄球菌A蛋白偶联的磁珠捕获，经荧光素酶试验检测与磁珠特异性结合的融合抗原；本发明使用的真核细胞表达的病毒抗原含有磷酸化等翻译后修饰，与感染情况下表达的病毒蛋白更相近，且无需纯化，简化了抗原的准备过程；与现有的间接ELISA相比，本发明的检测方法具有更好的检测的灵敏性和特异性；本发明检测方法具有简单、敏感、特异、价廉等优点，可以满足大规模检测的要求。
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公开(公告)号：CN114395583B
公开(公告)日：2024-03-29
申请号：CN202111284075.3
申请日：2021-11-01
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。
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公开(公告)号：CN115073613A
公开(公告)日：2022-09-20
申请号：CN202210747717.7
申请日：2022-06-28
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明涉及一种融合蛋白GLuc‑p30及其制备方法和应用，以非洲猪瘟的p30蛋白为诊断抗原，建立了一种基于荧光素酶免疫沉淀系统的非洲猪瘟抗体检测方法，该方法通过DNA转染真核细胞制备荧光素酶与p30的融合抗原，将该抗原分泌到细胞外，融合抗原与血清样本中的非洲猪瘟抗体结合后，被金黄色葡萄球菌A蛋白偶联的磁珠捕获，经荧光素酶试验检测与磁珠特异性结合的融合抗原；本发明使用的真核细胞表达的病毒抗原含有磷酸化等翻译后修饰，与感染情况下表达的病毒蛋白更相近，且无需纯化，简化了抗原的准备过程；与现有的间接ELISA相比，本发明的检测方法具有更好的检测的灵敏性和特异性；本发明检测方法具有简单、敏感、特异、价廉等优点，可以满足大规模检测的要求。
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公开(公告)号：CN116063563A
公开(公告)日：2023-05-05
申请号：CN202211203262.9
申请日：2022-09-29
Applicant: 扬州大学
IPC: C07K19/00 , C12N9/02 , C12N15/867 , G01N33/569 , G01N33/535 , G01N33/68
Abstract: 本发明提供一种融合抗原GLuc‑p30及其制备方法、试剂盒和检测方法，所述试剂盒包括：包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板、荧光素酶、融合抗原，非洲猪瘟抗体阳性血清，非洲猪瘟抗体阴性血清，荧光素酶底物、洗涤液，本发明通过慢病毒转导建立的稳定细胞株表达GLuc‑p30融合抗原，无需纯化，简化了抗原的准备过程，可以有效地检测样品中非洲猪瘟抗体，与符合国家标准非洲猪瘟抗体检测试剂盒的符合率达99％以上且有更好的检测灵敏性和特异性，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
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公开(公告)号：CN114395583A
公开(公告)日：2022-04-26
申请号：CN202111284075.3
申请日：2021-11-01
Applicant: 扬州大学
Abstract: 本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。
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