本发明提供了一种FLNB基因敲除的MDCK细胞株及其构建方法和应用。所述FLNB基因敲除的细胞株命名为MDCK‑FLNB‑KO，已于2024年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2024391。其中，FLNB基因敲除利用CRISPR/Cas9技术，针对MDCK细胞的FLNB基因第1号外显子设计sgRNA，构建FLNB基因敲除载体质粒1和质粒2；将质粒1和质粒2转染进MDCK细胞，获得FLNB基因敲除的MDCK细胞株。该细胞株较原始MDCK细胞株黏附能力降低，应用于流感病毒培养产量更高。