本发明属于基因工程和酶学领域，具体涉及脱乙酰基酶突变体及其在合成烯草酮中的应用，所述脱乙酰基酶突变体是由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第272位、92位、203位、304位、305位、306位、270位进行单点突变或多点突变，得到了对底物氯代乙酰胺特异性提高的突变体，其可以催化底物氯代乙酰胺合成氯代胺，用于后续烯草酮的生产，与野生型相比，突变体Y305E、Y305E/G304L、Y305E/H306F相对酶活提高分别是野生型的7.8倍、9.6倍、10.3倍，其中Y305E催化效率比野生型提高3.2倍，Y305E/H306F的催化效率比野生型提高4.2倍。使用本发明提供的脱乙酰基酶突变体合成氯代胺时，反应条件温和、对环境无害，且反应时间短，具有大规模生产氯代胺以及后续产品的应用前景。