本发明涉及一种第118位酪氨酸磷酸化MLC2抗体的制备方法，包括抗原的制备、免疫、亲和层析柱的制备以及抗体的制备为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在多肽链C末端增加一个半胱氨酸C，最终确定MLC2抗原表位多肽序列为KRAGGANS(p)NVFSMC；制备过程中采用两步法亲和纯化，先通过磷酸化层析柱，再通过非磷酸化层析柱做亲和去除；本发明的第118位酪氨酸磷酸化MLC2抗体的制备方法，适合规模化产出第118位酪氨酸磷酸化MLC2抗体，该抗体能识别MLC2第118位酪氨酸被磷酸化的状态，不识别非磷酸化状态，具备磷酸化特异性高，亲和力高的特点，比传统的Protein A纯化更加高效。