本发明公开了一种单通道双靶标数字PCR检测方法。所述方法包括如下步骤：1)构建混合PCR反应体系，所述混合PCR反应体系中包括第一靶标引物、第一靶标探针、第二靶标引物、第二靶标探针，其中，所述第一靶标探针与所述第二靶标探针的荧光报告基团相同，所述第一靶标探针与所述第二靶标探针浓度不同，以使第一靶标探针单独显色对应的第一荧光值A、第二靶标探针单独显色对应的第二荧光值B以及第一靶标探针与第二靶标探针共同显色对应的第三荧光值C能分层显示。本发明的检测方法能实现在单个荧光通道同时检测两种靶标基因，实现了高通量检测，提升了检测的效率。