本发明公开了一种基于介质微球的白光干涉图像超分辨三维重构方法，包括如下步骤：步骤1、待测物体和二氧化硅介质微球的放置；步骤2、开启白光干涉显微镜，获得一个视场下的待测物体的一组白光干涉图像；步骤3、重复步骤2，获得下一个视场下的待测物体的一组白光干涉图像；步骤4，重复步骤3；步骤5、通过ESPCN模型，获得M组高分辨干涉图；步骤6、提取像素值；步骤7、获得一个像素位置扫描高度值Hmax；步骤8、重复步骤7，得到所有像素点的扫描高度值Hmax；步骤9、重构物体三维形貌。优点，本发明方法，通过亚像素超分辨神经网络模型与介质微球白光干涉图像想结合，提高介质微球超分辨成像质量，从而改善“钝化现象”。