本发明涉及一种用于粪便和肠道内容物的87种胆汁酸的提取及定量检测的方法，旨在提供更全面的临床诊断指标，弥补现有总胆汁酸这一单指标的不足，并提供更准确可靠的定性和定量结果；通过在前处理过程中添加助剂AAA‑10，有效解决了粪便和肠道内容物样本的结合型胆汁酸水解的问题，确保了定量结果的准确性。本发明还通过巧妙运用质谱碰撞能量，采用平行反应监测pMRM策略，包括原型通道、验证通道Val和高能量通道HICE三种监测方式平行检测，实现一次进样的情况下，对极高和低浓度的胆汁酸全谱的准确定量。此外，通过优化液相色谱的条件，实现在15min的洗脱条件下，有效分离胆汁酸的所有同分异构体，本发明首次报道了牛磺α‑鼠胆酸和牛磺β‑鼠胆酸的液相色谱的基线分离。