本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及D‑氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用。本发明提供了D‑氨基酸氧化酶的突变体、核酸分子、重组菌株及其应用。本发明通过筛选获得了增强对催化底物DL‑草铵膦催化活力的突变型D‑氨基酸氧化酶，并通过添加融合标签或肽标签的方法，使得宿主表达获得的D‑氨基酸氧化酶的活性和可溶性表达进一步提高。利用本发明提供的D‑氨基酸氧化酶制备α‑酮酸的方法实现了外消旋草铵膦的动力学拆分，能够广泛应用到L‑草铵膦的生产应用中。