本发明公开了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体及湿菌体制备D‑阿洛酮糖的方法，涉及发酵技术领域，D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶重组大肠杆菌先后经LB平板培养基、LB液体培养基、种子培养基和发酵罐培养后，制得D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体，其菌丝量大，用于D‑果糖的转化，得到的D‑阿洛酮糖转化率高。同时采用甘油代替葡萄糖作为营养源，解决了葡萄糖积累抑制酶合成的问题，提高产酶活性，加入乙腈，利用乙腈增加细胞的渗透性，从而提高D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的转化率，使转化率最高可达到96％。