本发明公开了一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中所述三联体融合酶为一个烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与一个核糖激酶的肽链N端相连，和该核糖激酶的肽链C端与一个核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端相连的三联体多肽链，其中以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法是一种生物催化法，其以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料，和以所述三联体融合酶为酶催化剂，相对于现有的全酶法基于一次发酵即可制得烟酰胺单核苷酸，因而同全酶法具有安全与环保的优势，并相对于全酶法简化了工艺步骤而具有高生产效率和低廉的生产成本的优势。