本发明公开了一种鉴定黄瓜品种线粒体DNA指纹和杂交种纯度的方法及其引物组合。具体地公开了线粒体SNP分子标记组合及其引物组，该分子标记组合包括黄瓜线粒体DNA上的下列16个SNP位点：T9260C、T19048C、A31871C、G32757A、A52438C、G73219T、A263660C、T375476C、A590829T、A713222C、T728496G、G988117T、G1077680T、G1150455T、C1169752T和A1225858C。本发明的分子标记组合及引物组可用于鉴定黄瓜线粒体DNA指纹和一代杂交种纯度，对明确黄瓜的系谱和品种纯度具有重要的应用价值。