本申请提供一种用于靶向猪细胞系的FTO基因的gRNA，以及FTO基因敲除猪细胞系的构建方法。其中所述方法包括：利用基因编辑技术，破坏猪细胞系的FTO基因的第三外显子区域。本申请设计了特异性靶向FTO基因的gRNA，利用Cas9蛋白将FTO基因的第三外显子敲除，从而达到对细胞系进行基因敲除的目的。利用本申请方法得到的FTO基因敲除的猪细胞系对细胞增殖活性没有影响，可用于研究肥胖相关疾病的致病机理，并为进一步开发针对此类疾病的治疗方式提供服务。