本发明涉及一种基于PCR的DNA中PIK3CA基因突变检测试剂盒及检测方法，所述方法包括针对预设的突变靶点和野生型靶点设计的引物探针组；所述引物探针组的每个位点均设计有对应的序列；将不同点位的引物探针组进行组合，并将组合分成预设个数的检测孔；其中，不同的检测孔用于检测不同点位。本发明可以一次性地特异检测新鲜组织样本、石蜡包埋组织样本或血浆样本中DNA（gDNA或cfDNA）的PIK3CA的11个突变位点和4种野生型的位点，具有样本利用率高、分辨率高、灵敏度高、重复性好、操作简便、自动判读等优点。