本发明公开一种用于币斑病菌检测和物种鉴别的多重PCR反应体系的构建方法及其应用。本发明方法包括：获得币斑病菌多个物种全基因组序列，并进行多序列比对，获得各物种特有基因及特有基因簇；以各物种特有基因簇内基因为模板，按照常规引物设计方法设计出多个上游引物和下游引物，产生引物对，排除不合理的及敏感性和特异性较低的引物对。根据扩增产物大小，将引物自由组合搭配，产生四对引物混合的多重引物，优化多重PCR反应条件获得能够特异性检测币斑病菌并同时鉴别单个及多个物种的多重PCR体系。本发明提供的用于币斑病菌检测和物种鉴别的多重PCR方法，可以快速、准确的完成币斑病菌的检测并鉴别币斑病菌物种身份。