本发明涉及一种层出镰刀菌的检测方法及其应用，所述的检测方法包括特异性引物组：Fe‑EF‑spec1F/Fe‑EF‑spec1R。本发明有益效果为，1、现有技术中没有针对PCR检测烟草镰刀菌根腐病病原菌层出镰刀菌的特异性引物，本发明实现了零的突破；2、本发明研究筛选出的引物具有极高的准确度和特异性；3、综合使用本发明的方法，其最大灵敏度可达0.1ng/μL；4、本发明的应用在于检测疑似被层出镰刀菌侵染的烟株最小时间为24小时；5、本发明能在接种层出镰刀菌后早期检测到病原菌，达到烟草镰刀菌根腐病早期检测的目的，对于烟草镰刀菌根腐病的早期检测，预防和控制具有非常重要的意义和重大的经济意义。