一种用于猴痘病毒西非和中非分支双通道分型检测的组合物、试剂盒及其应用，属于核酸可视化检测技术领域。为了获得灵敏度高、特异性强、操作简单快速的猴痘病毒双通道分型检测方法，本发明提供了一种用于猴痘病毒西非和中非分支双通道分型检测的组合物，并基于该组合物建立了一种等温扩增技术与封闭式胶体金免疫层析试纸相结合的猴痘病毒西非和中非分支双通道分型检测方法。该方法能够高特异性检测猴痘病毒，具有较高的敏感性，既实现了结果的可视化，又避免了因气溶胶造成的假阳性结果，检测结果稳定可靠，有望实现疫病现场的快速可视化检测。