本发明涉及发酵技术领域，特别涉及一种羊栖菜发酵混合物及其制备方法和应用。该制备方法包括：将羊栖菜进行水煮脱砷、柠檬酸脱砷；将脱砷后的羊栖菜洗至pH中性，与水混合后打浆，pH值调至6.0～7.0；所得羊栖菜浆液与葡萄糖混合，灭菌；在羊栖菜浆液中接种益生菌进行发酵，益生菌为植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌；将发酵产物离心，取上清液，得到羊栖菜发酵混合物。本发明羊栖菜发酵混合物的发酵时间为24～72h，大大缩短了发酵时间，提高了效率；本发明羊栖菜发酵混合物具有显著的抗氧化、抗炎功效；本发明羊栖菜发酵混合物对肝癌细胞HEPG2、胃癌细胞SGC7901、肠癌细胞LOVO有极显著的生长抑制作用。