本发明提供了一种多肽和双生长因子梯度分布的含细胞骨软骨支架及其制备方法和应用，属于再生医学技术领域。本发明利用微流控通道对第一生物墨水、第二生物墨水和第三生物墨水的分散和汇聚过程，沿软骨下骨层方向，纳米羟基磷石灰浓度呈梯度逐渐变大，促进人骨髓间充质干细胞的矿化和诱导其分化为成骨细胞；转化生长因子和人骨形态发生蛋白沿骨‑软骨界面的垂直方向呈相反方向的浓度梯度分布，以梯度方式刺激人骨髓间充质干细胞的定向成骨分化和成软骨分化；精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸多肽沿着软骨下骨层和关节软骨层呈反向的梯度浓度分布，实现人骨髓间充质干细胞在骨软骨界面的定向成骨分化和成软骨分化，以便更好地对缺损的骨软骨组织进行修复。