本申请实施例提供了一种分离机构、运载火箭及其分离方法。分离结构包括：第一作动筒模组，包括第一筒体，具有第一销孔；第二作动筒模组，包括第二筒体以及活塞销，活塞销包括尾部和穿过第一销孔伸入第一筒体的首部；管路模组，包括气源、连接气源与第二筒体的第一进气管和第二进气管，第一进气管与第二筒体的连接处、第二进气管与第二筒体的连接处分别位于活塞销的尾部靠近、远离第一筒体的一侧。本申请实施例通过在级间段中设置分离机构，减少对接面数量，提高运载火箭整体刚度；分别导通第一进气管和第二进气管控制第二作动筒模组的延伸和收缩，从而对第一作动筒模组锁紧和解锁。安全环保，测试要求较低，可回收并重复利用，节省成本。