本发明提供单管检测多个待测目标核酸序列的方法及其试剂盒，所述方法利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现，所述方法包括：针对每个待测目标核酸序列设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物；退火时，所述探针及下游引物分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA‑RNA杂交链；通过不同待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测。本发明利用基于产物的熔解曲线检测多靶标核酸，控制RNA碱基5’端左侧序列的Tm值和探针的Tm值在一定的范围内，只需针对待测序列设计探针和下游引物，即可完成检测和扩增，降低扩增体系中的序列的数量，降低不同序列间多聚体形成，具有高的灵敏度和特异性。