本发明公开一种基于CRISPR‑Cas9系统进行枯草芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用。本发明通过对枯草芽孢杆菌基因组靶基因的crRNA进行同义突变，进而能够高效的对突变后宿主的相应靶基因进行定点编辑，包括步骤S1：crRNA序列的获得；S2：sgRNA表达质粒的构建；S3：crRNA同义突变设计；S4：CRISPR/Cas9质粒的构建；S5：枯草芽孢杆菌基因组编辑：将CRISPR/Cas9质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞中，丢去质粒，完成枯草芽孢杆菌基因组编辑。本发明还将该方法应用于枯草芽孢杆菌的分泌途径改造，特别是首次通过理性设计改造枯草芽孢杆菌分泌途径关键组分SecA提高了异源蛋白分泌效率。