本发明公开了一种基于聚集诱导发光比率荧光探针的ELISA检测方法，比率荧光探针包括红色和绿色的AIE荧光微球。将红色AIE微球偶联抗原，绿色荧光微球偶联生物素或地高辛抗体，ELISA包被抗体和链霉亲和素或地高辛全抗原。在ELISA反应体系中，红色AIE荧光微球偶联的抗原与ELISA上的抗体结合，在610nm处发出红色荧光，读值记为R；绿色AIE荧光微球偶联的生物素与ELISA板上的链霉亲和素结合或地高辛抗体与地高辛全抗原结合，在501nm处发出绿色荧光，读值记为G。通过计算R/G的值可以定量检测目标物浓度。本发明通过自校准将外部干扰降至最低，同时省去使用酶标二抗催化显色不稳定以及ELISA自身繁琐的步骤，为解决传统ELISA方法操作繁琐且易出现背景干扰等问题提供新技术和新思路。