本发明属于毒害有机污染物分析技术领域，公开了一种同步定量测定尿液中多类芳香族化合物与代谢产物浓度的方法。该方法是在尿液中依次加入同位素内标物、缓冲溶液及β‑葡萄糖醛苷酶‑芳基硫酸酯酶后，进行恒温酶解，酶解后加入有机溶剂萃取，离心后转移上清液，并浓缩定容至极性溶液中，通过定量和数据处理，得到尿液中多类目标物的浓度水平。本发明通过优化方案，实现对多类性质差异较大的芳香族化合物与代谢产物的同步检测分析，简化了实验步骤、降低了成本，提高了灵敏度，可有效应用于大批量尿液样品的检测分析。