本发明公开了一种山羊痘病毒的定量检测方法。该方法，包括：首先用病毒特异性检测法对目标峰进行鉴定；然后用蛋白测定仪测定标准品的浓度；将此标准品进行系列稀释，在液相色谱仪上检测标准品在280nm处的吸收峰，建立浓度和峰面积的线性回归方程；根据线性回归方程和待测样品的峰面积计算得到待测样品中的山羊痘病毒的含量。本发明的方法可用于山羊痘病毒悬浮培养液、纯化液及山羊痘灭活疫苗中山羊痘病毒的含量测定，具有快速、准确、稳定、重复性好的优点，可指导疫苗的生产，对提高疫苗品质起到重要作用。