本发明提供一种HBB融合基因修饰的自体造血干细胞、制备方法及其应用，属于遗传工程技术领域，所述HBB融合基因由以下模块依次串联得到：DNase I超敏位点HS2、DNase I超敏位点HS3、DNase I超敏位点HS4、启动子、增强子、HSb T88Q；所述HBB融合基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明利用核苷酸优化后的HBB融合基因修饰的CD34+细胞，分泌的人结合珠蛋白量更高，红系集落数量更多。