本发明公开了一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷D的方法，属于生物催化合成领域。本发明通过挖掘得到一种具有催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D活性的糖基转移酶，并通过定向进化得到高催化活性突变体YojK‑I241T/G327N。并将糖基转移酶突变体YojK‑I241T/G327N与来源于拟南芥的蔗糖合酶AtSuSy构建偶联反应，实现以莱鲍迪苷A为底物高效催化合成莱鲍迪苷D，以19.32g/L(20mmol/L)Reb A为底物反应15h，高效合成20.59g/L的Reb D，Reb D产率达到91.29％，为莱鲍迪苷D的生产提供了一条高效且绿色的新途径。